[단백질 정제] Ni-NTA 레진 재생 방법 (Ni-NTA Resin Regeneration protocol)

 

1. Ni-NTA 레진 재생이 필요한 이유

 

단백질 발현/정제 실험 시, His-tag 단백질을 Ni-NTA 레진을 통해 정제하는 경우가 많습니다. 이 레진은 여러 번 재사용이 가능하지만 반복 사용 시 Binding capacity(결합 능력)가 점점 감소하게 됩니다.

이때, 레진을 재생(regeneration)해주면 일정 수준까지 Binding capacity를 회복할 수 있습니다. 완전히 새 제품 수준은 아니지만, 경험상 실험에 지장을 줄 정도는 아니었습니다.

 

 

2. Ni-NTA 레진 재생의 기본 원리

레진 재생은 다음 3단계로 이루어집니다.

① 기존 Ni 이온 제거
② 침전 단백질 및 불순물 세척
③ Ni 이온 재부착

이 과정을 통해 레진을 재사용할 수 있습니다.

 

 

3. Ni-NTA 레진 재생 방법 

 

검색하면 다양한 재생 프로토콜이 나오지만, 큰 틀은 비슷합니다. 실험실 환경에 따라 세부 사항을 조정해 사용해도 무방합니다.

아래는 제가 Qiagen사의 프로토콜을 기반으로 실험실 환경에 맞춰 사용했던 방법입니다.

 

준비물

• Regeneration Buffer(6M GuHCl, 0.2M acetic acid)
• 25/50/100% EtOH
• 100mM EDTA pH 8.0
• 100mM NiSO4

 

레진 재생 순서

1. resin을 50mi conical tube에 회수
2. 회수한 resin을 방치 또는 centrifuge 돌려 레진 침전시킨 후 상등액을 최대한 제거
3. 회수한 resin 양의 약 2배 분량의 Regeneration Buffer(6M GuHCl, 0.2M acetic acid)를를 첨가
4. 상등액 버린 뒤 resin 양의 5배 분량 DW로 세척
5. resin 양의 1배 25% EtOH로 세척
6. resin 양의 1배 50% EtOH로 세척
7. resin 양의 1배 100% EtOH로 세척
8. resin 양의 1배DW로 세척
9. resin 양의 5배 100mM EDTA pH8.0으로 Ni이온 제거 (*Ni이온이 제거되며 레진이 하얗게 변함)
10. DW로 pH 중성 될 때까지 반복해서 세척 (*pH paper 이용해서 간략하게 측정 ok)
11. resin 양의 2배 이상의 100mM NiSO4 첨가한 뒤 세게 흔들어 resin에 Ni이온을 다시 부착
12. 깨끗한 DW로 세척 후 30% EtOH에 보관

 

팁 및 참고 사항

사용 중인 레진 제조사 제품소개서에 재생 방법이 기재되어 있는 경우가 많으니, 제조사 문서를 함께 참고하면 더 정확한 정보로 실험을 진행할 수 있습니다.

 

 

 

 

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