[단백질 정제] Ni-NTA 레진 재생 방법 (Ni-NTA Resin Regeneration protocol)

실험실에서 단백질 발현/정제시 발현 단백질에 His-tag를 붙여 발현시킨 뒤 Ni-NTA 레진을 이용해 단백질 정제를 하는 경우가 많이 있습니다. 이 방법의 경우 레진을 반복해서 사용하다 보면 Binding capacity가 떨어지게 되는데요 레진을 재생(Regeneration)하는 과정을 통해 Binding capacity를 어느정도 회복시킬 수 있습니다. 재생을 거치면 새 제품과 동일한 수준의 Binding capacity를 보장하지는 않다는 이야기도 있지만 경험상 크게 문제 되는 수준은 아니었던 걸로 기억합니다.

 

 

Ni-NTA 레진 재생 원리는

① 레진에 붙은 Ni 이온을 떼고

② 세척 과정을 통해 침전 단백질과 불순물을 제거한 뒤

③ Ni 이온을 붙여주는 과정

을 거치게 되고 이 과정을 통해 레진을 재사용 할 수 있습니다.

 

인터넷에서 레진 재생 방법을 검색하면 다양한 프로토콜이 뜹니다. 세부적인 부분은 조금씩 다르나 큰 틀 안에서는 같으니 본인 실험실 여건에 맞는 방법으로 진행하면 큰 문제없습니다.

 

 

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아래는 제가 사용했던 Ni-NTA 레진 재생 방법입니다.

Qiagen사에서 제공한 재생 방법을 살짝 변형해서 사용했습니다.

 

레진 재생 준비물

• Regeneration Buffer(6M GuHCl, 0.2M acetic acid)
• 25/50/100% EtOH
• 100mM EDTA pH 8.0
• 100mM NiSO4

 

레진 재생 방법

1. resin을 50mi conical tube에 회수
2. 회수한 resin을 방치 또는 centrifuge 돌려 레진 침전시킨 후 상등액을 최대한 제거
3. 회수한 resin 양의 약 2배 분량의 Regeneration Buffer(6M GuHCl, 0.2M acetic acid)를를 첨가
4. 상등액 버린 뒤 resin 양의 5배 분량 DW로 세척
5. resin 양의 1배 25% EtOH로 세척
6. resin 양의 1배 50% EtOH로 세척
7. resin 양의 1배 100% EtOH로 세척
8. resin 양의 1배DW로 세척
9. resin 양의 5배 100mM EDTA pH8.0으로 Ni이온 제거 (*Ni이온이 제거되며 레진이 하얗게 변함)
10. DW로 pH 중성 될 때까지 반복해서 세척 (*pH paper 이용해서 간략하게 측정 ok)
11. resin 양의 2배 이상의 100mM NiSO4 첨가한 뒤 세게 흔들어 resin에 Ni이온을 다시 부착
12. 깨끗한 DW로 세척 후 30% EtOH에 보관

 

본인이 사용하는 레진 제조사의 제품소개서에 재생 방법이 기재되어 있기도 하니 제품소개서를 참고하는 것도 좋은 방법입니다.