[분자생물학실험] Competent cell 제조 방법

 

Competent cell는 세균(주로 E. coli)에 화학적 처리를 통해 클로닝시 도입하고자 하는 유전자가 잘 들어갈 수 있도록 인위적으로 만든 세포를 말합니다. 줄여서 cp cell이라고 부르기도 합니다.

클로닝을 밥먹듯이 하는 랩에서는 그만큼 사용하는 Competent cell이 많다보니 적절한 균주를 이용해 Competent cell을 직접 만들어 사용하는 것이 일반적입니다.

 

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아래는 제가 Competent cell 제조시 사용한 프로토콜입니다.

 

- 사전 준비물

: 50ml LB broth, 1M CaCl2(멸균), 50% glycerol(멸균), 멸균 DW, 아이스메이커 얼음

 

- 제조 방법
1. Competent cell 제조 이틀전 LB plate에 균을 접종한다.

2. 플레이트에 자란 프레시한 균을 피킹해 10 ml LB broth에 접종, overnight 배양한다.

3. 충분히 키운 2를 50ml LB broth 에 500ul 접종한다.

4. 37도 쉐이킹 인큐베이터에서 O.D.600=0.4가 될 때 까지 키운다. (대략 2~3시간)

5. 50ml 코니칼 튜브에 4를 옮긴 뒤 얼음에 20분간 꽂아둔다.

6. 15ml 코니칼 튜브에 아래 a, b를 만든뒤 얼음에 20분간 꽂아둔다.
   a. 1M CaCl2 300ul + 50% glycerol 600ul + DW 2.1ml (총 3ml)
   b. 1M CaCl2 3ml + DW 27ml (총 30ml)

 

7. 5를 4,000rpm에서 15분간 centrifuge 진행한다.

8. 7의 상등액 버린 뒤 6에서 제조한 b용액 1ml로 파이펫으로 cell을 잘 풀어준다. 

cell이 잘 풀리면 나머지 29ml을 넣고 얼음에 30분간 꽂아둔다.

9. 8을 4,000rpm에서 15분간 centrifuge 진행한다.

10. 9의 상등액 버린 뒤 6에서 제조한 a용액 1ml을 넣고 파이펫으로 cell을 조심스럽게 풀어준다. 

이 때 cell은 가급적이면 계속 차가운 상태를 유지하도록 한다.

11. 10을 ep tube에 50ul씩 소분 한 뒤 deep freezer에 보관한다.